کروماتوگرافی لایه نازک(Thin Layer Chromatography) (TLC)

کروماتوگرافی لایه نازک نوعی کروماتوگرافی جذبی جامد – مایع است و اصول آن مانند کروماتوگرافی ستونی است. ولی در این مورد جسم جاذب جامد را به صورت یک لایه نازک در روی یک قطعه شیشه یا پلاستیک محکم پخش میکنند. یک قطره از محلول نمونه یا مجهول را در نزدیکی لبه صفحه میگذارند و صفحه را همراه مقدار کافی از حلال استخراج کننده در ظرفی قرار میدهند. مقدار حلال باید آنقدر باشد که فقط به سطح زیر لکه برسد (شکل الف). حلال به طرف بالای صفحه میرود و اجزاء مخلوط را با سرعتهای متفاوت با خود میبرد. در نتیجه ممکن است تعدادی لکه روی صفحه ظاهر شود. این لکه ها روی یک خط عمود بر سطح حلال ظرف قرار میگیرند (شکل ب).

این روش کروماتوگرافی بسیار آسان است و به سرعت هم انجام میشود. این روش برای تفکیک اجزاء یک مخلوط بسیار مفید است و همچنین میتوان از آن برای تعیین بهترین حلال استخراج کننده جهت کروماتوگرافی ستونی استفاده کرد.

در TLC میتوان از همان مواد جامد که در کروماتوگرافی ستونی استفاده میشود استفاده کرد و در این میان سیلیکا و آلومینا بیشتر به کار میرود. معمولا جسم جاذب را با مقدار کمی از ماده نگهدارنده مانند گچ شکسته بندی، کلسیم سولفات و یا نشاسته مخلوط میکنند تا جسم جاذب چسبندگی لازم را پیدا کند و به صفحه بچسبد. صفحه ها را میتوان قبل از مصرف تهیه کرد و یا از ورقه های پلاستیکی آماده که در بازار موجود است استفاده نمود.

یکی از مزایای مشخص TLC آن است که احتیاج به مقدار بسیار کمی از نمونه دارد. در بعضی موار میتوان تا مقدار ^9-10 گرم را تشخیص داد. اما ممکن است اندازه نمونه تا 500 میکرو گرم برسد. در نمونه های زیاد میتوان از تجربه های تهیه ای استفاده کرد. در این تجربه ها لکه های مختلف را میتراشند و با یک حلال مناسب میشویند (استخراج میکنند). و برای شناسایی (از طریق طیف سنجی) به کار میبرند.

تشخیص لکه های رنگین در روی کروماتوگرام آسان است و برای تعیین محل لکه های اجسام بیرنگ روشهای متعددی وجود دارد. برای مثال میتوان با تابش نور ماوراء بنفش به صفحه محل لکه، ترکیبهایی را که خاصیت فلوئورسانس دارند مشخص کرد. به روش دیگر میتوان جسم جاذب را با ماده فلوئورسانس دار بی اثر دیگری مخلوط کرد. هنگامی که نور ماوراء بنفش به این صفحه بتابد، لکه اجسامی که نور ماورای بنفش را جذب می‌کنند ولی خاصیت فلوئورسانس ندارند در زمینه فلورسانس دار صفحه به صورت تیره رنگ ظاهر میشوند. در بسیاری موارد دیگر، از معرفهای آشکارساز دیگری استفاده میکنند. این معرفها را میتوان بر روی کروماتوگرام پاشید و لکه ها را ظاهر کرد. سولفوریک اسید، که بسیاری از ترکیبات آلی را به ذغال تبدیل میکند و محلول پتاسیم پرمنگنات نمونه هایی از معرفهای آشکار ساز هستند که به این روش مصرف میشوند. ید نیز معرف آشکار ساز دیگری است که مصرف میشود. در این مورد صفحه را در ظرفی میگذارند که محیط آن از بخار ید اشباع باشد. بسیاری از ترکیبات آلی ید را جذب میکنند و لکه آنها روی کروماتوگرام رنگین (معمولا قهوه ای) میشود.

در شرایط معین سرعت حرکت ترکیب نسبت به سرعت پیشرفت حلال (R_f) خاصیت مشخصی از ترکیب است. برای تعیین این مقدار مسافتی را که جسم از خط شروع تا وسط لکه را طی کرده است اندازه میگیرند و آنرا به مسافتی که حلال پیموده تقسیم میکنند. این مسافت را با خط شروع یکسانی میسنجند.

بخش عملی

تفکیک مواد رنگی برگ سبز

چند میلی لیتر از مخلوط 2 به یک اتر نفت و اتانول را همراه با چند برگ سبز در هاونی بگذارید و برگها را با دسته هاون له کنید. مایع بدست آمده را به یک قیف جدا کننده منتقل کنید و همان حجم آب مقطر به آن اضافه کنید و تکان دهید. فاز آبی پایینی را دور بریزید. این شستشو را دو بار انجام دهید و هر بار فاز آبی را دور بریزید. و آب تازه اضافه کنید.لایه آلی (بالایی) را به ارلن کوچکی منتقل کنید و به آن 2 گرم سدیم سولفات بدون آب اضافه کنید (برای آب گیری).

یک نوار 10 سانتی از ورقه کروماتوگرام سیلیکاژل تهیه کنید و یک لکه 1 الی 2 میلی متری از محلول ماده رنگی را طوری بر روی صفحه قرار دهید که حدود 1 و نیم سانتی متر از انتهای آن فاصله داشته باشد (برای گذاشتن لکه از لوله مویین تمیز استفاده کنید). صبر کنید تا لکه خشک شود. برای جداسازی، از حلال بنزن – استون با نسبت 7 – 3 (حجمی) مطابق توضیحات بالا استفاده کنید.

ممکن است تا هشت لکه رنگین مشاهده شود. این لکه ها به ترتیب کاهش مقدار Rf عبارتند از کاروتنها (دو لکه نارنجی)، کلروفیل a (آبی – سبز)، کلروفیل b (سبز) و زانتوفیلها (چهار لکه زرد).

کروماتوگرافی ستونی (Column Chromatography)

در کروماتوگرافی ستونی جسم بین فازهاى مایع و جامد پخش میشود. فاز ساکن جسم جامدی است و این جسم اجزای مایعی را که از آن میگذرد به طور انتخابی در سطح خود جذب میکند و آنها را جدا میکند. اثرهایی که باعث جذب سطحی میشوند همان اثرهایی هستند که موجب جذب در مولکولها میشوند. این اثرها عبارتند از: جاذبه الکترواستاتیکی، ایجاد کمپلکس، پیوند هیدروژنی، نیروی واندروالس و غیره.

برای جدا کردن یک مخلوط با کروماتوگرافی ستونی، ستون را با جسم جامد فعالی (فاز ساکن) مانند آلومینا یا سیلیکاژل پر میکنند و کمی از نمونه مایع را روی آن میگذارند. نمونه ابتدا در بالای ستون جذب میشود. سپس حلال استخراج کننده ای را در داخل ستون جریان میدهند. این فاز مایع متحرک، اجزای مخلوط را با خود میبرد. ولی به علت نیروی جاذبه انتخابی فاز جامد، اجزای مربوط میتوانند با سرعتهای مختلفی به طرف پایین ستون حرکت کنند. ترکیبی که با نیروی کمتری جذب فاز ساکن شود سریعتر خارج میشود زیرا که درصد مولکولی آن در فاز متحرک از ترکیبی که با نیروی زیادتری جذب فاز ساکن میشود بیشتر است.

اجزای تفکیک شده را میتوان مجددا به دو روش به دست آورد:

1) مواد جامد ستون را میتوان خارج کرد و قسمتی از آنرا که حاوی باند مورد نظر است برید و با حلال مناسب استخراج کرد.

2) چون باندها با زمانهای مختلفی خارج میشوند میتوان آنقدر حلال را از ستون عبور داد تا باندها از انتهای آن خارج شوند و در ظرف جداگانه ای بریزند.

معمولا روش دوم کاربرد بیشتری دارد.

در مورد اجسام رنگین میتوان باندهایی را که به طرف پایین ستون می آیند مستقیما مشاهده کرد.

 اما در مورد اجسام بیرنگ نمیتوان تغییرات را مستقیما مشاهده کرد. با این حال بسیاری از اجسام در هنگام تابش نور ماورای بنفش فلوئورسانس پیدا میکنند و در چنین مواردی از این خاصیت جهت مشاهده باندها استفاده میشود. معمولا برای پی بردن به جریان عمل کروماتوگرافی ستونی حجمهای کوچک و ثابتی (مثلا 25 میلی لیتر) از محلول استخراج شده را جمع آوری میکنند. سپس حلال آنها را تبخیر میکنند تا ببینند جسمی در آنها وجود دارد یا خیر. گرچه ممکن است یک جسم در چند ظرف پخش شود، ولی اگر حجم هر جزء نسبتا کم گرفته شود (مثلا کمتر از 10% حجم ستون) معمولا باندهای مختلف در ظروف مختلف جمع آوری میشوند. روش دیگری که برای پی بردن به وضع تفکیک مناسب آن است که محلول استخراج شده در فاصله زمانی مختلف با کروماتوگرافی لایه نازک مورد بررسی قرار گیرد.

تعدادی از جاذبهای جامدی که عموما مصرف میشوند عبارتند از: آلومینا، سیلیکاژل، فلورسین، زغال چوب، منیزیم اکسید، کلسیم کربنات، نشاسته و شکر. معمولا شیمیدانهای آلی از آلومینا، سیلیکاژل و فلورسین بیشتر استفاده میکنند.

آلومینا (Al₂O₃) ترکیب قطبی بسیار فعالی است که قدرت جذب زیادی دارد و به سه صورت موجود است: خنثی، شسته شده با اسید و شسته شده با باز. آلومینای بازی برای ترکیبهای اسیدی و آلومینای اسیدی برای ترکیبهای بازی قدرت تفکیک خوبی نشان میدهد. در ترکیبهایی که به شرایط اسیدی و بازی حساسیت دارند و واکنش شیمیایی دارند باید از آلومینای خنثی استفاده کرد. آلومینا با قطبیت زیادی که دارد ترکیبهای قطبی را به شدت جذب میکند و در نتیجه ممکن است استخراج آنها از ستون را مشکل کند. فعالیت (قدرت جذب) آلومینا را میتوان با افزایش کمی آب کاهش داد، درجه فعالیت آلومینا با درصد وزنی آب موجود مشخص میشود. سیلیکاژل و فلورسین هم قطبی هستند ولی قطبیت آنها از آلومینا کمتر است.

برای اینکه جاذبهای جامد نیروی موثرتری داشته باشند، باید اندازه ذرات آنها یکنواخت و سطح مخصوص آنها زیاد باشد. چنین سطحی باعث تسریع تعادل جسم در دو فاز میشود. این حالت در ایجاد باندهای باریک اهمیت دارد.

در تعیین شرایط یک تجربه کروماتوگرافی باید به ماهیت فاز مایع (حلال) مصرفی توجه کرد. حلال نیز میتواند در جسم جامد جذب شود و به این وسیله برای جذب مواضع جذبی که در سطح جامد وجود دارند، با جسم حل شده رقابت کند. چنانچه حلال قطبی تر باشد و شدیدتر از اجزای مخلوط جذب شود، تقریبا تمام اجزاء در فاز مایع متحرک باقی میمانند و تفکیکی که در ضمن تجربه صورت میگیرد ناچیز خواهد بود. در نتیجه برای این که تفکیک خوب انجام شود باید قطبیت حلال استخراجی به طور قابل ملاحظه ای کمتر از اجزای مخلوط باشد. به علاوه باید اجزای مخلوط در حلال حل شوند، زیرا در غیر این صورت اجزا به طور دایم در فاز ساکن ستون جذب میشوند و در آن باقی میمانند. قدرت استخراجی حلالهای مختلف (یعنی توانایی آنها در انتقال یک جسم معین به پایین ستون) بترتیب زیر از بالا به پایین زیاد میشود:

هگزان

کربن تترا کلرید

تولوئن

بنزن

دی کلرومتان

کلروفرم

دی اتیل اتر

اتیل استات

استون

پروپانول

اتانول

متانول

آب

در یک کروماتوگرافی ستونی ساده نمونه را در بالای ستون میگذارند و در طول تفکیک از حلال واحدی استفاده میکنند. بهترین حلال انتخابی، حلالی است که بیشترین فاصله را در باندها ایجاد کند. چون احتمالا بهترین حلال در اثر تجربه بدست می آید، گاهی راحتتر است که در انتخاب حلال برای کروماتوگرافی ستونی از روش کروماتوگرافی لایه نازک استفاده شود. تعداد زیادی از تجربه های کروماتوگرافی لایه نازک را میتوان با استفاده از حلالهای مختلف، در زمان نسبتا کوتاهی انجام داد. معمولا بهترین حلال یا مخلوط حلالی که به این روش به دست می آید برای کروماتوگرافی ستونی مناسب است.

معمولا از روشی که به استخراج تدریجی (یا جزء به جزء) معروف است استفاده میشود. در این روش برای ظهور کروماتوگرام از یک سری حلالهایی استفاده میکنند که قطبیت آنها مرتبا رو به افزایش میرود. در شروع با یک حلال غیر قطبی (معمولا هگزان) ممکن است یک باند به طرف پایین ستون حرکت کند و از آن خارج شود و در این حال باندهای دیگر در نزدیکی ابتدای ستون باقی بمانند. سپس حلالی که قطبیت آن اندکی بیشتر است به کار میبرند. در حالت ایده آل باید یک باند دیگر خارج شود و در این حال بقیه باندها در عقب آن باقی بمانند. چنانچه قطبیت حلال یکباره زیاد بالا رود، ممکن است تمام باندهایی که باقی مانده اند یکباره از ستون خارج شوند. بنابر این باید در هر مرحله قطبیت حلال به مقدار کم و با قاعده معینی افزایش یابد. بهترین راه انجام این کار آن است که از حلالهای مخلوط استفاده شود و تعویض کامل حلال چندان مناسب نسیت.

طریقه پر کردن ستون بسیار اهمیت دارد زیرا ستونی که خوب پر نشود اجزاء را هم خوب تفکیک نمیکند. جسم پرشده باید همگن باشد و در آن هوای محبوس یا حباب بخار وجود نداشته باشد.

آماده سازی ستون کروماتوگرافی

یک بورت 50 میلی لیتری را در حالت عمودی به گیره ای ببندید. شیر بورت باید بسته و چرب نشده باشد. بورت را با اتر نفت (60-30 درجه ) تا نزدیکی درجه 40 میلی لیتری آن پر کنید و به کمک یک لوله شیشه ای طویل کمی پشم شیشه را به انتهای بورت فرو برید. درون بروت به حدی شن بریزید تا ارتفاع 1 سانتی متری بالای پشم شیشه را بپوشاند. پس از خروج کامل حبابهای درون شن، در حالی که به آرامی به دیواره بورت ضربه میزنید 15 گرم آلومینا را به داخل لوله بریزید. هنگام پایین رفتن آلومینا ستون را تکان دهید. این اعمال به پر شدن یکنواخت ستون کمک میکنند. جدار داخلی بورت را که آلومینا به آن چسبیده با اتر نفت اضافی بشویید. برای محافظت از آلومینای پر شده یک لایه 1 سانتی متری شن در بالای ستون قرار دهید. شیر بورت را باز کنید و بگذارید تا حلال خارج شود و درست به بالای لایه شن بالایی برسد. حال ستون برای قرار دادن نمونه مخلوط مورد تفکیک آماده است.